GMP认证咨询|重组人源化胶原蛋白原材料制造过程控制-生产用细胞的质量控制

（二）生产用细胞的质量控制
         连续传代细胞生产重组人源化胶原蛋白材料的最大优点是使每批胶原蛋白材料都有一个经过检定的共同起源细胞，因此建立细胞库的目的就是为了保证生产的可持续性和胶原蛋白材料质量的稳定。重组人源化胶原蛋白材料的生产必须建立在有良好的细胞库管理基础上，载体细胞可以是细菌、酵母或其他真核细胞，已通过筛选、育种、复苏等程序验证建立细胞库而实现工程化，具有稳定的遗传表达和相应的质量控制体系。本部分以针对动物细胞库的管理为例，进行相关阐释。
         需建立细胞库系统（细菌、酵母、哺乳细胞等其他）保存管理的相应制度及文件，保证细胞库符合相关标准要求，保障细胞库的稳定性，需对细胞库进行质量检测，包括质粒核酸序列、拷贝数、丢失率检测；杂菌检测（计数、菌落形态观察、菌种鉴定）等；需提供细胞库检测报告。
1.细胞库建立 
         细胞库可为三级即原始细胞库、主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB）；也可采用主细胞库和工作细胞库组成的两级细胞库；在某些特殊情况下，也可使用主细胞库一级库。用于建库的初始工程细胞株需为经过克隆选择而形成的均一细胞群体，必要时须经与实际生产过程所用培养基和培养条件相一致的适应性培养。
2.建库细胞的管理 
         在制备工作细胞库过程中不得进行单克隆筛选，以避免由于个别基因突变引起工作细胞库中细胞群体性的遗传特性改变；为了保证细胞库中每个容器中的内容物完全一致，如培养细胞采用几个器皿的，需将所有培养皿中的细胞混合成单批后再分装。 
         在细胞库的建库期间需采取适宜的预防措施，以确保细胞不被污染（包括微生物污染和实验室中其他类型细胞的交叉污染等）。各级种子库的细胞需按照特定的要求经过全面检定合格后方可使用（具体要求参见本文细胞库检定）。
动物细胞库建库的具体过程、方法和管理需符合中国药典要求。
3.细胞库检定
         正确的起始细胞是实现良好生产的前提和基础。检定的目的是为了确认经过初步筛选建库的细胞符合预期设计要求，携带有稳定的目的基因，能够持续表达有功能活性的目的产物，没有微生物污染和混杂其它细胞，能够直接扩增储备或者应用于生产。 
         对于原始库细胞和/或主库细胞，通常需要进行一次全面系统的研究检定，包括遗传学、生物学和微生物学，以便从源头开始严格控制起始细胞的一致性和防止污染。经过传代稳定性研究的主细胞到工作细胞，只经过简单的传代、扩增，可以适当简化检定项目，重点检测外源因子污染和防止混入了其它细胞。保存的数目和传代水平需保证生产用细胞的持续稳定供应。
3.1细胞鉴定
         要进行目的蛋白表达稳定性分析，即确证表达产物的蛋白质序列与预期相符。
3.1.1细胞种属的鉴定
         需验明细胞的种属来源，分析细胞的同一性，排除与其它细胞的交叉污染。鉴别试验可利用细胞的表型或遗传型特征，通常对MCB作鉴别试验，而对每个WCB仅作有限的鉴别试验。 
目前常用的方法有细胞生长特征和培养形态学检查、种属特异性抗原检测、染色体核型分析、同工酶分析、限制性内切酶分析、基因多态性分析等。需结合具体细胞固有的特性进行适宜的组合和选择，以实现正确鉴别为目的。 
         真核细胞用于生产时，细胞的鉴别标志，如特异性同功酶或免疫学或遗传学特征，对鉴别所建立的种子是有用的。有关所用传代细胞的致癌性需有详细报告。如采用微生物培养物为种子，则需叙述其特异表型特征。
3.1.2致瘤性试验 
         对于动物细胞，需检测分析目的基因引入细胞后的致瘤性特征，对于阳性细胞，需研究确定致瘤性改变对胶原蛋白材料带来的安全性风险。种子批不应含有外源致癌因子。
3.1.3目的基因和表达框架分析 
         目的基因和表达框架的确证是种子库细胞检定的重要组成部分，对于表达正确的目的产物具有先决性意义。常用的方法包括：通过PCR扩增样本DNA来进行DNA序列分析；通过限制性内切酶谱和Southern杂交来检测基因的完整性，确定目的基因的拷贝数，并检测是否有任何序列插入或缺失等。 
         基因序列分析资料需包括试验方案和步骤、原始的测序图、测得序列以及翻译后的氨基酸序列，同时需将实际测得序列与理论序列进行对比。清楚标注两者之间的异同。一般情况下，在原始种子阶段需确证克隆基因的DNA序列。但在某些情况下，例如传代细胞基因组中插入多拷贝基因。在此阶段不适合对克隆基因作DNA序列分析。在此情况下，可采用总细胞DNA的杂交印染分析，或作mRNA的序列分析。对最终胶原蛋白材料的特征鉴定需特别注意。
         为保证胶原蛋白材料结构的正确和稳定，基因序列分析需贯穿于重组工程细胞的筛选和鉴定、细胞库的建立和检定以及生产细胞培养监控的全过程。
3.1.4表达产物检测 
         需检测分析目的产物的表达量和生物活性。活性测定需选择与其预期用途相对应并能够定量的方法。活性测定方法学研究可贯穿于重组人源化胶原蛋白原材料研究的始终，并经相关验证分析。
3.2微生物污染检测
3.2.1细菌、真菌和支原体检查 
         对于动物细胞库，需对MCB、WCB和EPC（生产终末期细胞）进行全面检查，对生产培养过程中的细胞进行监测。在进行支原体检查时，需注意同时进行培养法和指示细胞法两种方法，或经验证的qPCR法。必要时可采用扫描电镜法检查细胞是否受到特殊微生物的污染。在设计检测微生物细胞库中外源微生物因子和外源细胞污染的特异性试验方法时，需考虑以下问题：建库细胞的性质、科技文献中报道的可能存在的污染、用于细胞培养的细胞来源、方法和材料以及存在于建库实验室中的其他生物等。
3.2.2病毒因子的检查 
         包括细胞来源宿主动物潜在的内源性病毒和由于操作带入的外源性病毒的检查。对细胞进行病毒检查的种类和方法，需根据细胞的种属和组织来源、传代历史和细胞特性选择。
3.2.1.1体外试验
         需将MCB、WCB和EPC细胞活细胞或细胞裂解产物接种到尽可能多的病毒易感的指示细胞上。可以根据细胞来源，传代史和细胞培养基的原料使用情况来选择适宜的指示细胞。检测结果需为阴性。
3.2.1.2体内试验
         通过接种乳鼠、成年小鼠、鸡胚、豚鼠、家兔或其它敏感动物来检测细胞培养物中潜伏性病毒。通常要对MCB、EPC进行体内试验。 
3.2.1.3种属特异性病毒的检定
         通过抗体产生试验来检测可能存在于MCB细胞中的种属特异性病毒，如啮齿类动物来源的细胞需进行小鼠、仓鼠或大鼠的抗体生成试验。严格控制对于人类有危害的鼠源性病毒。 
3.2.1.4逆转录病毒的检测
         逆转录病毒的试验需包括感染性试验、逆转录酶（RT）检测和电镜技术检查。需采用上述方法对MCB和EPC细胞进行逆转录病毒的检测。
3.2.1.4.1感染性试验
         需根据细胞的特性及可能存在的逆转录病毒种类选择适宜的检测方法，如XC空斑试验（XC plaque）、延时XC空斑试验、S＋L－灶点分析（S＋L－Focus）等。试验时需注意设立恰当的阴/阳性对照。 
3.2.1.4.2逆转录酶检测
         为提高检测的敏感性，通常需要将受试细胞经适当的化学诱导剂诱导后，收集上清液分别与检测细胞联合培养，再检测逆转录酶的活性，注意设立恰当的阴/阳性对照。
3.2.1.4.3透射电镜检查
         透射电镜下可观察细胞基质超微结构的形态学特征以及逆转录病毒和病毒样颗粒的存在，需比较未经和经过化学诱导剂诱导的细胞。另外，需要对细胞培养液超速离心后所得的沉淀物经负染后进行检查。观察有无逆转录病毒颗粒以及颗粒的类型。 
         上述三种方法具有不同的检测特性和灵敏度。因此，需采用不同的方法联合检测。若逆转录酶活性检测阳性时，建议进行透射电镜检查或感染性试验，如果确证对人或者其它灵长类动物细胞有感染性的逆转录病毒颗粒，该细胞不可用于生产。
4.细胞稳定性研究
         需包括库细胞、生产过程中细胞、生产终末期和/或超过生产终末期等不同培养时期的细胞。库细胞需重点考察贮存、复苏等操作处理因素的影响和传代过程中的遗传稳定性，在此基础上确定库细胞传代限度，也需基于质粒拷贝数及其在载体细胞内的状态限定生产过程中载体细胞的最高传代次数，验证试验所涉及的传代范围需等于或超过规定的细胞最高限定代次。生产过程中细胞、生产终末期和/或超过生产终末期细胞需考察模拟生产工艺和培养条件对细胞生长状况、表达能力等的影响，并确定生产细胞增殖限度和/或连续培养时间；使细胞始终能够持续、稳定地表达重组人源化胶原蛋白，并将对最终胶原蛋白原材料产生安全性影响的风险因素严格控制在最低限度。 
4.1贮存条件下的稳定性 
         当储存的细胞复苏后用于生产胶原蛋白材料时，需进行细胞存活率和功能活性等与细胞质量密切关联项目的研究测定，以证实复苏细胞表达能力的稳定性，需有对建库细胞贮存条件下稳定性监测的方案。这种监测需在一支或多支冷冻保藏的WCB复苏后制备生产用细胞时进行，或当一支或多支冷冻保藏的MCB复苏并用于制备新WCB时进行。如果长时间未进行生产时，需按上市申请时所述的间隔时间对生产用细胞库进行活力测试。如果细胞的活力没有明显的减退，一般不需对MCB或WCB作进一步检定。 
4.2传代/扩增过程中的稳定性 
         需对库细胞和生产过程细胞进行传代/扩增的稳定性研究，可将复苏的库细胞连续传代培养至一定的代次和将工作库细胞在模拟实际生产条件下连续培养、扩增（逐级放大扩增过程），直至预期培养时间以及超过预期时间之外的延长时间点，收获后进行检测分析。通过考察目的基因、表达框架等在重组工程细胞中的传代稳定性和目的产物表达的稳定性，制定库细胞的限传代次和生产细胞的增殖限度以保证实际生产过程中细胞整体扩增水平以及伴随的内源性病毒和/或致瘤性风险等的抑制状态在预期限度范围内。至少需包括以下方面的试验研究：
4.2.1基因水平的比较
         目的基因编码序列和表达框架不应有错误，包括突变、缺失、插入。并注意比较基因拷贝数的变化。 
4.2.2目的产物表达水平的比较
         目的产物的表达量和表达活性不应有明显降低，根据不同的重组人源化胶原蛋白和具体研究结果确定适宜的可接受标准。 
4.2.3细胞自身的稳定性
         需重点检测细胞在传代/扩增过程中的形态、生长、代谢等基本状况，遗传特征和致肿瘤特性的变化。 
4.2.4内源因子检查
         需动态考察内源因子的复制是否得到有效抑制。重点检测由细胞来源动物和宿主细胞特性所决定的易染病毒如内源性逆转录病毒，分析其对于人类的致病性和重要性，严格控制其产生的条件。 
4.2.5致瘤性监测
         对于致瘤性试验阳性的细胞，尤其对动物细胞，需通过比较研究考察细胞培养传代过程中致瘤性特征的改变，例如试验阳性时的细胞代次、最低接种量、肿瘤转移扩散、肿瘤增殖时间、瘤组织病理特征等。建议对不同剂量（低、中、高）进行不同宿主细胞的致瘤性试验，直至筛选出低致瘤性细胞。
5.生产过程细胞质量控制
         种子库细胞需在全面质量研究和检测分析基础上，模拟实际生产过程进行扩增培养，并检测分析目的基因表达的稳定性、细胞生长状况、污染控制、致肿瘤风险性等；规模化生产后须建立细胞生产培养过程的监控标准，生产细胞培养终末期需符合质量控制相关要求。 
         对于内源性逆转录病毒和/或致瘤性试验阳性的细胞，需依据工艺处理能力制定风险性成分的控制条件，并根据模拟生产状态下取得的试验研究数据制定废弃收获液的标准；生产工艺须包括有效的病毒和/或致瘤性成分的灭活/去除方法并经过充分验证。 
         如果整个培养过程中的关键环节例如培养基、培养条件、培养时间和/或限制代次、培养方式等发生重大改进，细胞培养工艺进行了放大，影响了原已确定的监控标准，需重复进行一次全面的检测验证。
5.1常规生产过程监控 
         经研究确定了生产工艺条件之后，常规生产过程中可重点监测微生物污染和细胞生长状况，例如活细胞数目和形态、代谢和功能状态、目的蛋白表达状况、潜伏性逆转录病毒基因组激活状况、细菌和支原体污染以及其它要求等，在比较分析的基础上确定批次或者连续培养生产的终末细胞的检测项目及可接受标准。
5.2细胞增殖限度 
          在细胞稳定性试验研究的基础上，需结合细胞培养、维持等工艺过程中实际采用的生产方式如批式培养（batch culture）、流加培养(fed-batch culture)、灌注培养(perfusion culture)等各自特点，考察细胞体外连续扩增、培养过程中发生的变化，例如细胞的生长状态、内源性病毒抑制状态、目的蛋白表达的下降程度以及致瘤性改变等确定适宜的收获方式、收获时间、细胞终止培养时间和/或增殖代次，并预留充分的安全储备。实际生产过程中细胞不得超过预先设定的培养时间和/或增殖限度
5.3其它风险性因素控制 
         培养基对细胞的质量有直接的影响，也是细胞污染的可能来源之一。需明确培养基的组成、来源及质量标准。对于动物源性添加成分，需尽可能控制并减少其使用；如确需使用，需阐明选择的理由，并说明该成分的来源和病毒安全性控制方法。目前提倡采用无血清培养基，并尽可能减少用于处理细胞（例如从贴壁状态中游离或者分散）的动物来源的蛋白酶。各种培养基的来源和质量检测数据均需有可追溯的文件记录。如培养中使用了牛源性物质，需明确其来自非BSE疫区，并需按照国家食品药品监督管理局的相关规定提供必要的证明性文件。 
细胞培养条件的研究中，需考察使内源性逆转录病毒复制和癌基因相关序列激活或者复制受抑制的控制条件，对模拟生产条件下的状况进行分析，确定可实际控制的程度。生产中需严格执行研究确定的控制条件。
6.风险评估与控制
         细胞系/库的建立，其序列的设计、生产用材料、制备工艺、质量、稳定性、内包材的要求可依具体情况，结合细胞系/库的质量研究结果进行综合评估。可结合生产使用情况和细胞系/库的研究和检测情况，制定重组人源化胶原蛋白原材料的风险控制策略。良好的重组人源化胶原蛋白原材料质量研究与控制有利于筛选、建立出质量良好的细胞系/库，有利于后续的生产研究。在细胞系/库建立过程中，建议对细胞系/库进行检定和传代稳定性研究，关注细胞系/库功能是否符合理论设计和预期、安全是否可控，必要时对工程细胞进行相应的质量研究，以确认其适用性。
随着技术不断更新和研究经验的逐步积累，研发过程常常伴随重组人源胶原合成表达系统的升级和工艺的优化，因此研发各阶段有可能发生变更。系统的变更可能显著影响工程细胞的安全性和有效性，是重要风险之一，研发者需评估变更引入的影响和风险。根据风险评估情况，对重组人源胶原合成表达系统及其工程细胞的质量、工艺控制、稳定性等方面进行深入研究，合理设计变更可比性研究方案。